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活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

文章来源: 党婷婷,王晓娟 中草药杂志社       发布时间:2018-12-22

白及多糖(Bletilla striata polysaccharide,BSP)是从白及药材中提取得到的多糖,由甘露糖和葡萄糖(2.4∶1)以β糖苷键聚合而成,具有抗炎、抗氧化、抗纤维化[1]等生物学活性,而且无毒副作用、可生物降解、相容性好,已被广泛用于药物制剂领域[2-6]。此外,有文献报道BSP可被巨噬细胞表面的甘露糖受体和β-葡聚糖受体有效识别,因此,制备BSP载体可用于巨噬细胞靶向[7-8]。然而BSP作为药物载体时,由于其水溶性较强,不利于疏水性药物的包封,其应用受到限制。许多研究者尝试对其进行疏水性修饰,采用诸如硬脂酸、胆甾醇琥珀酰基、硫酸酯等对其进行修饰,以改善其疏水性[9-13]。


本实验采用活性氧(reactive oxygen species,ROS)响应基团[14]4-(羟甲基)苯硼酸频那醇酯(PBAP)[15-17]对BSP进行修饰,得到ROS敏感的BSP(Oxi-BSP)。该新材料具有两亲性结构,PBAP为疏水段,BSP为亲水段。该材料可在水溶液中自发形成胶束[18];以具有抗氧化作用的姜黄素(Cur)作为模型药物进行包封,制备包载Cur的ROS敏感胶束,其中BSP可特异性识别Kuffercell(KC)表面的受体,载体被KC特异性摄取后,在KC内高浓度ROS作用下,苯硼酸酯被氧化,化学键断裂,释放出药物,发挥抗氧化作用。


1仪器与试药


Lambda 35紫外-可见分光光度仪,Perkin Elmer公司;78HW-1数显恒温磁力搅拌器,杭州仪表电机有限公司;Master-sizer 2000激光粒度分析仪,英国马尔文公司;BT125D电子天平,德国赛多利斯公司;索莱宝透析袋MD34,截留相对分子质量8 000~14 000;BSP,质量分数90%,西安朗泽生物科技有限公司;PBAP、N,N′-羰基二咪唑(CDI)、4-二甲氨基吡啶(DMAP),麦克林试剂公司;Cur原料药,质量分数98%,批号201406,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DMSO,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其余试剂为分析纯,水为二次纯化水,实验室自制;Cur对照品,质量分数98.9%,批号110823-201405,中国食品药品检定研究院。


2方法与结果


2.1 PBAP的活化


将0.500 g PBAP溶于15 mL无水二氯甲烷中,再加入CDI0.692 g,搅拌下反应30 min。将混合物用二氯甲烷稀释,再用10 mL双蒸水洗涤3次,弃去水层。有机相用12 mL饱和氯化钠溶液洗涤,弃去氯化钠层,在无水硫酸钠中干燥,真空干燥浓缩后得到纯白色固体,即得活化的4-(羟甲基)苯硼酸频那醇酯(CDI-PBAP),反应式见图1。

活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

2.2白及多糖的修饰


将BSP 762.8 mg置于50 mL圆底烧瓶中,加入8 mL无水DMSO溶解后,加入DMAP 0.466 g,再加入CDI-PBAP 1.000 g,将混合物搅拌过夜。修饰后的BSP在10 mL双蒸水中沉淀后,10 200×g离心15 min分离产物。将分离后的产物用10 mL双蒸水洗涤2次,然后离心除去上清液。冷冻干燥去除残余水分,得到Oxi-BSP,反应式见图2。

活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

2.3结构表征

活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

2.3.1 CDI-PBAP的表征1H-NMR图谱采用Bruker Avance 400 MHz核磁光谱仪(瑞士Bruker公司)测定,结果见图3。反应物和聚合物的红外图谱(IR)采用显微红外光谱仪(VERTEX70)测定,波数范围4 000~400 cm?1,结果见图4。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.15(1H,s),7.86(2H,d,J=7.6 Hz),7.44(2H,d,J=7.6 Hz),7.27(1H,s),7.07(1H,s),5.43(2H,s),1.35(12H,s)。IR图谱中,从PBAP到CDI-PBAP 3 300 cm?1左右的峰消失,说明原料中-OH被反应,同时1 750 cm?1羰基峰、1 500~1 000 cm?1苯环特征峰的出现可以推断PBAP上的-OH已经与CDI上的-COOH连接在一起。上述结果表明合成物结构与目标化合物一致。

活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

2.3.2 Oxi-BSP的表征方法同“2.3.1”项,结果见图5。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.59(2H,d,J=7.6 Hz),7.29(2H,d,J=7.6 Hz),5.10(2H,s),1.21(12H,s)分别为苯环上的4个H、羟甲基上-CH2的2个H、4个-CH3的12个H。IR图谱中,从BSP到Oxi-BSP,1 730 cm?1附近酯键基团的出现,表明PBAP被连接到BSP上,且还伴有许多PBAP峰,如苯环特征峰的出现,证明产物为目标化合物。


2.4 Oxi-BSP载药胶束的制备


精密称取50 mg Oxi-BSP和5 mg Cur,溶于5 mL有机溶剂(甲醇-DMSO 1∶1),磁力搅拌使其充分混匀。将混合溶液转移至截留相对分子质量为8 000~14 000的透析袋中,置于500 mL去离子水中透析,分别于第2、4、6、8、12、24小时更换新鲜去离子水。透析完成后,取出透析袋内的溶液,以3 000 r/min离心10 min,上清液用0.45μm微孔滤膜滤过,即得到载药胶束水溶液。


2.5载药量和包封率的测定[19-20]


精密吸取胶束溶液1 mL,置100 mL量瓶中,加甲醇至刻度,再超声5 min,破坏胶束结构,0.45μm微孔滤膜滤过,测定A值,按标准曲线所得回归方程计算药物质量浓度,按公式计算包封率和载药量。


包封率=(W胶束中药量/W投药量)


载药量=(W胶束中药量/W胶束质量)


2.5.1确定检测波长取Cur对照品及空白胶束适量,用无水乙醇溶解并稀释至适当浓度后滤过,在200~800 nm波长进行紫外扫描。Cur对照品在422 nm处有最大吸收波长且空白胶束无吸收,因此确定422 nm为Cur的检测波长。


2.5.2标准曲线的绘制取Cur对照品适量,加无水乙醇配制成一系列质量浓度的对照品溶液,分别测定A值。以对照品溶液的A值(Y)对其质量浓度(X)进行线性回归,得回归方程Y=0.143 6 X-0.011 6,r2=0.999 9,结果表明Cur在1.194~7.164μg/mL与A值呈良好的线性关系。


2.5.3精密度试验分别取低、中、高3组不同质量浓度的Cur对照品溶液,于1 d内每隔2 h测定A值,计算日内精密度。连续测定6 d,计算日间精密度。低、中、高3组日内精密度RSD值分别为1.02%、1.01%、0.894%,日间精密度分别为1.94%、0.538%、0.541%,表明此方法精密度良好。


2.5.4加样回收率试验取空白胶束1 mL,分别加入质量浓度为1.426 mg/mL的Cur溶液0.8、1.0、1.2 mL,置50 mL量瓶中,甲醇定容,再取1 mL置10 mL量瓶中,定容至刻度,测定A值,计算回收率为98.97%,RSD为2.1%,表明此方法准确度高。


2.6单因素考察


2.6.1透析温度的确定固定其他条件,将药物和载体的溶液分别置于4、12、20、28、37℃中,搅拌透析24 h,制备载药胶束,制备方法同“2.4”项,测定其粒径、载药量,方法同“2.5”项,结果其粒径分别为117.60、96.52、77.16、134.20、121.00 nm,载药量分别为8.510%、7.231%、8.620%、7.483%、6.031%。


2.6.2透析时间的选择分别于12、18、24、30、36 h从透析袋中取出样品,制备载药胶束,制备方法同“2.4”项,测定其粒径、载药量,方法同“2.4”项,结果其粒径分别为80.91、114.20、77.16、133.30、190.80 nm,载药量分别为8.790%、8.426%、8.620%、7.615%、4.348%。


2.6.3投药量的选取固定载体的用量及其他条件,分别制备不同投药量5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mg的载药胶束,制备方法同“2.4”项,测定其粒径、载药量,方法同“2.5”项,结果其粒径分别为77.16、155.10、163.00、214.70、215.60、222.50、232.70 nm,载药量分别为8.620%、11.090%、10.670%、14.640%、16.380%、12.170%、7.100%。


2.6.4透析介质的筛选固定其他条件,以去离子水、生理盐水、pH 5.0的PBS溶液分别制备载药胶束,制备方法同“2.4”项,测定其粒径、载药量,方法同“2.5”项,结果其粒径分别为77.16、0(表示无法形成胶束)、0 nm,载药量分别为91.920%、0、0。


2.6.5有机溶剂(DMSO与甲醇)混合比例的筛选固定其他条件,以DMSO与甲醇比例为1∶1、1∶4、4∶1分别制备载药胶束,制备方法同“2.4”项,测定其粒径、载药量,方法同“2.5”项,结果其粒径分别为77.16、159.10、0 nm,载药量分别为91.920%、69.430%、0。


2.7正交设计法优化处方和制备工艺


2.7.1正交设计根据单因素考察的结果,选择影响Oxi-BSP载药胶束载药量的3个主要参数作为考察对象,即透析时间(A)、透析温度(B)和投药量(C),每个因素设置3个水平,按照正交设计L9(33)表进行试验,优选最佳处方和制备工艺,因素水平见表1。

活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

2.7.2结果分析根据表1条件制备Oxi-BSP载药胶束,并测定载药量,结果见表1,方差分析结果见表2。


由表1可知各因素对载药量的影响依次为B>C>A,即透析温度对载药量的影响最大,其次是投药量,透析时间的影响最小。

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由表2可以看出,透析温度对载药量的影响均具有显著性差异(P<0.05),透析时间在所选水平上无显著性差异,综合考虑经济节能等方面,可将透析时间调整为18 h,因此,最优工艺条件为A1B2C2,即透析时间为18 h,投药量为15 mg,透析温度为20℃。


2.8验证试验

活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

结合既定的工艺和参数,按照最佳处方和制备工艺条件,制备3批Oxi-BSP载药胶束,测定粒径、包封率和载药量,结果见表3,由表可知,在优化工艺条件下的平均载药量为(20.21±0.44)%,而且较为稳定,包封率和粒径均较为理想,说明该方法可行,工艺的重复性良好。


2.9 Oxi-BSP载药胶束理化性质的表征


2.9.1形态学研究在最佳处方和制备工艺条件下,制备胶束,用适量去离子水稀释至一定倍数,滴加在覆盖碳膜的铜网上,晾干,透射电镜下观察形态和大。?峁???-A,由图可知,Oxi-BSP载药胶束呈圆球状,大小均匀,成形性好。

活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征

2.9.2载药胶束氧化降解取载药胶束适量,加入过氧化氢模拟体内环境,孵育6 h,结果如图6-B。可以看出胶束边界:,说明胶束结构已被破坏,同时激光粒度仪粒度分布PDI为1.000,说明胶束被破坏,粒径不再均匀,初步判断Oxi-BSP载体材料具有氧化响应性。

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2.9.3粒径及粒径分布取Oxi-BSP载药胶束,用适量去离子水稀释后,激光粒度分析仪测定其粒径及粒径分布,结果见图7,平均粒径为225.33 nm,多分散系数(PDI)值为0.081。


3讨论


本实验采用生物可降解性的BSP为原材料,通过采用ROS响应基团PBAP对其-OH进行修饰,合成了既有亲水基团,又有疏水基团的新材料,该材料在水溶液中可自发形成胶束,通过选用Cur为模型药物进行包封,成功制备载药胶束。


关于制备方法的选择,本实验考察了薄膜水化法[21]、溶剂挥发法[22]、透析法[23],由于所用的有机溶剂为DMSO和甲醇,而DMSO沸点高,难挥发,薄膜水化法、溶剂挥发法无法将DMSO完全除去,但可以DMSO与水互相混溶,故采用透析法除去有机溶剂,制备载药胶束。


由单因素结果可知透析时间增长,载药量下降,可能是随着时间增长,胶束结构不稳定,因考虑到12 h DMSO未能完全透析出来,将透析时间控制在18 h左右;4℃时,DMSO难以从透析袋中透出,部分Cur溶解在DMSO中成溶液,测得载药量高,结果存在偏差,温度大于20℃时,载药量显著降低,因此将透析温度控制在20℃左右;投药量对载药量影响较大,当投药量大于15 mg时,载药量显著降低,因此将投药量控制在15 mg左右,当透析介质是PBS或者生理盐水时,无法形成胶束,可能是载体大分子材料出现类似盐析效应,具体情况有待作进一步考察。


在单因素考察的基础上,选择对Oxi-BSP载药胶束载药量影响最显著的因素进行正交试验设计,优选出最佳处方和制备工艺为投药量15 mg,透析时间18 h,透析温度20℃。通过验证,发现该工艺优越、合理、可重复性高,可作为筛选处方和工艺的一种切实有效的手段。


参考文献(略)


来源:党婷婷,王济,唐鹏,王晓娟.活性氧响应的白及多糖载药胶束制备及其表征[J].中草药,2018,49(23):5548-5553.

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